转自：楚天人

外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质、蛋白质、核酸等多种物质的纳米级囊泡，直径在30～150nm。外泌体在人体中分布广泛，人体的外周血、尿液、乳汁、羊水等体液中均含有外泌体。外泌体参与多种生物功能并发挥重要作用，包括蛋白质、RNA和脂质等生物分子的转移及多种疾病生理和病理过程的调节，被认为是疾病诊断、治疗和预后的重要的生物标志物和药物载体，因此，开发简便高效的外泌体分离纯化技术已成为推动精准医学发展的重要研究方向，对实现疾病早诊早治和个体化治疗方案制定具有关键性意义。

粒径分离法

粒径分离法是根据外泌体与其他生物分子之间粒径大小的差异对外泌体进行分离。主要包括超滤法和凝胶过滤法。

超滤法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧，而将相对大分子物质截留在超滤膜上，以达到分离的目的。

凝胶过滤层析是基于不同粒径大小物质在通过多孔凝胶填料过程中移动的速度不同，对不同大小颗粒进行分离的方法。当含有不同大小分子的混合样品进入层析柱后，大分子物质因无法进入凝胶颗粒内部微孔，只能在凝胶颗粒间的空隙流动，路径短、流速快；而小分子物质能够进入凝胶颗粒内部的微孔，在其中穿梭，流动路径长、流速慢。随着洗脱液不断流过层析柱，不同大小的分子便依据此差异，按由大到小的顺序先后被洗脱出来，从而实现对混合样品中各组分的分离。外泌体的分子粒径大于一般的蛋白分子，所以外泌体会先被洗脱下来，而粒径小的蛋白质会被后洗脱下来，从而分离出高纯度的外泌体。

根据外泌体和杂质的分子量不同，可以选择合适的凝胶过滤填料，推荐使用TA-4FF、TA-6FF。TA-4FF和TA-6FF分别为4%和6%的琼脂糖经过乳化、漂洗、多次交联、分筛而成的凝胶过滤介质，TA-6FF分离范围为10KDa-4000KDa，TA-4FF分离范围为60KDa-20000KDa，广泛用于多糖、核酸、病毒等生物大分子的分离纯化或者检测。

复合模式层析法

Core 400和Core 700适用于对病毒和其他大生物分子进行中度纯化和精纯。新型核心层析技术和多模式配基使得Core 400/700能够使用一种层析填料发挥双重功能：分子排阻和结合层析。

外泌体样品流经Core 400/700柱床时，大于400/700KDa的外泌体从外水流穿，属于凝胶过滤的原理对目标物进行纯化；小于400/700KDa的杂质进入内水后，通过微球内部的辛胺复合功能基团进行吸附结合，属于离子交换和疏水多模式作用，可以去除目标物中的宿主蛋白等杂质，从而达到对目标物流穿、杂质结合的分离纯化目的，广泛用于外泌体等生物大分子的纯化。

Core 400/700层析介质具有高流速、低反压、高处理量、良好的化学稳定性和机械性等特点，方便进行规模放大，可缩短生产时间，提高生产效率。

亲和层析法

亲和层析法根据抗原抗体免疫反应，使抗体与外泌体表面相应抗原特异性结合以实现外泌体的分离。

利用外泌体表面存在的特异性标志物（如四跨膜蛋白CD63、CD81、CD9，以及肿瘤来源外泌体上的一些特异性抗原等），与固定在层析介质上的相应配体（如抗体、适配体等）发生特异性结合。

当含有外泌体的样品通过层析柱时，外泌体因其表面标志物与配体的特异性相互作用而被捕获在层析介质上，而其他杂质则随流动相流出。随后，通过改变洗脱条件（如pH值、离子强度或添加竞争性配体等），破坏外泌体与配体之间的相互作用，将纯化的外泌体从层析柱上洗脱下来。

推荐使用填料：TA-CNBr 4B、TA-CNBr 4FF、TA-Epoxy 6B。

离心分离法

离心法根据囊泡、细胞、细胞碎片及蛋白分子等在溶液中沉降系数的差异，通过逐渐增加离心力或者离心时间对外泌体进行分离，包括差速离心法和密度梯度离心法。

差速离心法利用外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等，通过不同离心速度分离出去，从而得到纯净的外泌体。

密度梯度离心法是在差速离心法的基础上，根据囊泡与其他生物分子密度和大小的差异，加入分离介质，利用外泌体的密度范围，使其在溶液中停留在不同梯度层，从蛋白质聚集体和非膜性颗粒中分离外泌体。

沉淀法

沉淀法根据化合物与外泌体的理化特性，利用共沉淀或者反向筛选的方式对外泌体进行分离纯化。

聚合物沉淀法是通过高分子的疏水聚合物可以改变外泌体溶解性和分散性的特点，使其能够在比较低的离心力下沉降出来。

有机溶剂沉淀法是一种利用与水互溶的有机溶剂使蛋白质溶解度显著降低，从而发生沉淀，反向分离外泌体的方法。

微流控技术

微流控法纯化外泌体主要基于外泌体的多种物理和生物学特性，如大小、形态、电荷以及表面标志物等。

利用微流控芯片上的微小通道和特殊结构，使含有外泌体的生物样品在微小的流体通道中流动，通过设计不同的分离机制，实现外泌体与其他杂质的分离。

然而，到目前为止，由于缺乏方法验证，缺乏标准化，以及较低的样本体积处理能力，限制了微流技术在分离纯化外泌体中的应用。

外泌体分离纯化技术的不断发展为它的深入研究与临床应用奠定了重要基础。当前，尽管超速离心、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀和微流控等主流技术各具优势，但在分离效率、纯度、操作复杂度及成本效益间的平衡仍是亟待优化的核心挑战。随着纳米材料科学和工程技术的交叉融合，新一代外泌体纯化平台有望突破规模化生产的瓶颈，推动其在液体活检、靶向药物递送及再生医学等领域的转化应用。唯有通过跨学科协作与技术迭代，才能真正释放外泌体作为“天然纳米载体”与“疾病标志物”的双重潜力，为精准医学开辟新的诊断与治疗维度。

（转自：楚天人）