植物拥有复杂的先天免疫系统来抵御各种病原体。核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列的免疫受体（NLR）是植物先天免疫系统的关键组成部分。NLR蛋白能够识别病原体分泌的效应蛋白，并触发一系列防御反应，包括程序性细胞死亡，从而限制病原体的传播。NLR蛋白是植物中最多样化的蛋白质家族之一，不同NLR亚类以不同的速率进化。然而，NLR进化速率与其功能角色之间的关系仍不清楚。

来自英国The Sainsbury Laboratory的Sophien Kamoun和AmirAli Toghani*（共同通讯作者）团队在_bioRxiv_发表题为“A hierarchical immune receptor network in lettuce reveals contrasting patterns of evolution in sensor and helper NLRs”的论文，揭示了莴苣中NRC（NLR Required for Cell Death）免疫受体网络呈现出一种层级结构，其中感应NLR和辅助NLR表现出不同的进化模式。

主要研究结果

菊目（Asterales）与茄目（Solanales）相比，NRC网络扩张程度较低：

研究团队分析了40个茄目和29个菊目植物的基因组，发现与茄目相比，菊目植物的NRC网络扩张程度显著较低，这体现在感应NLR和辅助NLR的数量都较少（图1B和S2）。在菊目和茄目中，每个基因组平均分别有300个和338.6个非冗余NLR。然而，NRC超家族NLR在菊目基因组中平均只占NLRome的6.6%，而在茄目中占50.3%（图S2）。

图1B图S2

进一步分析发现，菊目中88个NRC辅助蛋白分为两个亚类：一个包含27个序列，与保守的NRC0聚类；另一个包含61个序列，与已知的茄科NRC辅助蛋白（如NRC2和NRC4）聚类，被称为Ast-NRC（图1B和S2）。所有504个菊目NRC感应蛋白形成一个不同的、得到良好支持的分支，与茄科SD型感应蛋白聚类，但没有一个与Rx型茄科感应蛋白聚类（图1B）。尽管菊目NRC感应蛋白属于SD型，但它们缺乏N端的茄科结构域特征（图1B，数据S3）。

莴苣中NRC辅助蛋白和感应蛋白经常在基因组中聚集：

研究团队分析了普通莴苣（Lactuca sativa）和两个野生莴苣种（Lactuca saligna和Lactuca virosa）的40个NRC-H和NRC-S序列（数据S4）。系统发育分析揭示了莴苣属NRC超家族序列中的四个亚类：一个辅助蛋白分支、感应蛋白分支1、2和3（图2A）。基于先前对莴苣NLR家族的分类，NRC超家族分支序列分布在四个RGC组中：NRC辅助蛋白分支为RGC7，感应蛋白分支1为RGC26，感应蛋白分支2为RGC27，感应蛋白分支3为RGC9（图S3）。

图2

研究团队进一步分析了NRC超家族序列在莴苣基因组中的物理位置。与先前在各种菊科植物中的观察结果不同，莴苣NRC0（LsatNRC0；Helixer_NC_056625.2_001598.1）位于3号染色体上，不靠近任何感应蛋白序列（图2B）。相比之下，Ast-LsatNRC1（Helixer_NC_056630.2_002654.1）位于8号染色体上，与来自2和3分支的感应蛋白位于一个物理簇中（<100kb）。值得注意的是，所有3分支的感应蛋白都聚集在这个染色体上，该聚集是先前报道的MRC8c的一部分（图2B）。其余的莴苣NRC-S序列，包括来自1分支的序列，分散在4、8和9号染色体上，分别是MRC4、8a和9a的一部分（图2B）。只有LsatNRC0不属于任何已报道的MRC（图2B）。

LsatNRC0和Ast-LsatNRC1是不同NRC感应蛋白系统发育分支的细胞死亡信号所必需的：

为了研究莴苣NRC网络的功能连接，研究团队在Nicotiana benthamiana的nrc2/3/4 CRISPR敲除系中使用了农杆菌介导的瞬时共表达试验。通过共表达NRC-S和NRC-H，研究团队评估了它们潜在的功能连接以及莴苣NRC-S对两个NRC辅助蛋白的依赖性。在测试的15个NRC-S中，9个在与一个或两个野生型NRC共表达时，作为自激活突变体显示出超敏反应（HR）。3个NRC-S仅通过LsatNRC0诱导细胞死亡，而4个仅通过Ast-LsatNRC1起作用。值得注意的是，两个感应蛋白与LsatNRC0和Ast-LsatNRC1都有功能连接（图3、S8B、数据S7）。

通过分析细胞死亡表型以及莴苣NRC网络超家族的系统发育树，研究团队观察到辅助蛋白依赖性在感应蛋白分支内的系统发育转变。具体来说，所有依赖LsatNRC0的感应蛋白都属于分支1，而依赖Ast-LsatNRC1的感应蛋白位于分支3。有趣的是，与两个辅助蛋白都有功能的NRC-S是位于分支1和3之间的分支2成员（图3A）。这些观察结果表明，莴苣中存在一个具有部分冗余信号通路的功能性NLR网络（图3B）。

图3

与NRC辅助蛋白不同，NRC感应蛋白在使用AlphaFold 3建模时不能形成类抗病小体寡聚体：

研究团队利用AlphaFold 3对NRC-H和NRC-S进行六聚体建模。结果显示，AlphaFold 3成功地为两个NRC辅助蛋白序列建立了类抗病小体寡聚体模型，尽管它无法在任何LsatNRC0预测结构中生成完整的N端漏斗（图4）。这与之前对NRC0寡聚体建模的观察结果一致（Madhuprakash等人，2024）。相比之下，来自三个感应蛋白分支的NRC-S都不能形成类抗病小体结构（图4）。在所有重复中，NRC-S模型始终显示出低置信度和高预测比对误差（图4和S9）。

图4

高度可变位点定位于不同NRC-S亚类中的不同结构域：

尽管具有共同的进化起源，NRC感应蛋白和辅助蛋白表现出功能多样性。研究团队对每个辅助蛋白和感应蛋白分支进行了香农熵分析。结果显示，莴苣NRC辅助蛋白分支在其整个长度上表现出最小的变异，只有23个残基超过了1.5的熵阈值。这些可变残基主要位于CC结构域内。保守基序，如MADA、P-loop和MHD，也具有较低的熵值（图5A和5B，数据S10）。相比之下，感应蛋白分支显示出显著的变异：NRC-S分支1和3包含大量可变残基（分别为146和128个），而分支2（28个残基）超过了1.5熵阈值。在分支1中，观察到三个高度可变残基簇：一个在CC结构域的中间，两个在NB-ARC和LRR结构域的N端附近（图5A和5B，数据S10）。在分支2中，少数可变残基分散在整个NLR序列中。有趣的是，分支3在LRR结构域重复序列的凹面上显示出可变残基的集中（图5A和5B，数据S10）。

图5

与依赖LsatNRC0的感应蛋白相比，依赖Ast-LsatNRC1的感应蛋白受到更高的正向选择：

为了研究影响NRC辅助蛋白和NRC-S亚类突变的选拔压力，研究团队使用PAML v4.10.7软件中的CodeML进行了正向选择测试。结果表明，对于辅助蛋白分支，M2 vs M1 (0) 和 M8 vs M7 (6.379) 的计算LRT没有超过x2临界阈值（1%显著性下为9.21；自由度=2；数据S11）。相反，M3 vs M0 (69.097) 的LRT超过了阈值（1%显著性下为13.28；自由度=4；数据S11），表明M3（离散）模型比M0（中性）更适合数据。然而，在替代模型（M2、M3、M8）中没有发现正向选择的位点（图6A；数据S11）。

对于感应蛋白分支1，所有三个LRT比较产生的值都超过了x2阈值，支持替代模型更适合数据（M2 vs M1 = 22.079，M3 vs M0 = 392.939，M8 vs M7 = 58.949；数据S11）。在M8（beta + a）模型下，贝叶斯经验贝叶斯（BEB）分析（Yang等人，2005）揭示了五个正向选择位点（后验概率> 0.95）。将这些位点映射到代表性分支1感应蛋白NLR的AlphaFold 3预测结构上，发现其中三个位点位于CC结构域（图6B）。

对于感应蛋白分支3，所有三个LRT比较都支持替代模型（M2 vs M1 = 337.837，M3 vs M0 = 1372.561，M8 vs M7 = 400.550；数据S10）。M8模型下的BEB分析确定了48个正向选择位点（后验概率> 0.95）（图6A；数据S11）。将这些位点映射到代表性分支3感应蛋白NLR的AlphaFold 3预测结构上，发现48个位点中有33个位于LRR结构域内（图6C）。值得注意的是，这些位点中的大多数聚集在LRR的凹面上，根据先前的研究，该区域与效应蛋白结合有关（图6C）。

图6

全文总结与展望

这项研究通过比较基因组学和功能实验，揭示了莴苣中NRC免疫受体网络的层级结构和进化动态。研究发现，与茄科植物相比，菊科植物（包括莴苣）的NRC网络扩张程度较低，这可能与其他类型的NLR（如TIR-NLR）的扩张有关。在莴苣中，NRC辅助蛋白和感应蛋白在基因组中经常聚集，但不同物种之间存在差异。功能分析表明，莴苣NRC感应蛋白依赖于不同的NRC辅助蛋白来介导细胞死亡信号，并且这种依赖性在感应蛋白的不同进化分支之间存在转变。此外，研究还发现，与NRC辅助蛋白不同，NRC感应蛋白不能形成类抗病小体结构，并且不同感应蛋白分支在序列变异和受到的选择压力方面存在显著差异。

这项研究揭示了NRC网络中辅助蛋白和感应蛋白之间对比鲜明的进化轨迹，以及不同感应蛋白分支之间的差异。NRC网络通过提供组织特异性或病原体特异性的抗性来介导对多种病原体的强大免疫反应。辅助蛋白和感应蛋白分支的多节奏进化可能赋予了网络多样化和对抗广泛病原体的灵活性，同时允许特化和潜在的新免疫功能的采用。

未来的研究需要进一步探索调控辅助蛋白特异性和感应蛋白-辅助蛋白相互作用的分子机制，这将有助于阐明这些免疫受体在不同植物谱系中是如何适应和进化的。

研究团队与资助

该研究由英国The Sainsbury Laboratory的Sophien Kamoun和AmirAli Toghani（共同通讯作者）领导，第一作者是Hsuan Pai。

这项研究得到了盖茨比慈善基金会、生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）以及欧洲研究委员会（ERC）等机构的资助。

DOI链接

https://doi.org/10.1101/2025.02.25.639832

小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn

投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com

（转自：小麦研究联盟）

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